신종 코로나바이러스와 진단키트


 
지난 COVID-19에 관한 몇 가지 포스팅에 이어서 오늘은 신종 코로나바이러스(COVID-19) 진단키트에 대하여 알아볼까 합니다.
 
최근 한국의 바이오 기업이 제조, 생산하는 진단키트들의 높은 정확도와 세계적 찬사를 받으며 그 존재감이 날로 커지고 있는데요, 이탈리아, 스페인, 프랑스, 독일과 같은 유럽 국가를 비롯하여 미국에까지 수출하고 있습니다. 특히 미국 수출건의 경우 까다롭기로 유명한 FDA까지 긴급사용승인을 받아 한국의 진단키트에 대한 대내외적 인지도가 어느 정도인지 가늠해볼 수 있습니다. 이렇듯, 진단키트가 무엇이기에 이토록 한국의 진단키트들이 찬사를 받는지, 신종 코로나바이러스에 진단키트가 중요한 이유가 무엇인지 해당 포스트를 통해 유익한 정보 많이 얻어가시길 바랍니다!




최근 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)로 인해 많은 사람들이 진단키트에 대한 관심이 높아졌습니다. 진단키트는 각종 질병, 임신 여부, 건강 상태, 친자 확인 등 여러 분야에서 각 목적에 맞게 필요한 시약 및 도구 등을 포함한 생화학 실험 도구를 뜻합니다. 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)가 전 세계 보건의료를 극심하게 뒤흔들고 있는 상황에서 한국은 진단키트를 통해서 신속 정확하게 진단하여 대처하고 있습니다.



특히 '방역 한류'라 불릴 정도로 국내에 여러 업체들(씨젠, 솔젠트, 시선바이오 등)에서 제작한 진단키트를 전 세계 곳곳에서 구하려고 힘쓰는 상황입니다. 전 세계에서도 여러 업체가 진단키트를 생산하나 각국의 법적 규제, 생산 라인, 기술 등의 문제로 국내산 진단키트만큼 생산량도 많지 않고 정확도도 낮은 경우가 많습니다. 진단키트에 활용되는 여러 가지 기술은 배양법, 항원-항체 반응, qRT-PCR 등이 있으며 현재 승인이 된 방법은 항원-항체 반응, qRT-PCR입니다.


 



 

 


일반적으로, 코로나바이러스는 전염성은 강하지만 병원성이나 치사율은 낮은 바이러스입니다. 그러나 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)는 전염성도 강하면서 제법 치명적인 병원성을 가지는 특이 변종입니다. SARS-CoV-2의 WHO 공식 치사율은 4월 현재 약 6.7%입니다.



코로나바이러스 중에서 치사율이 1%를 넘기는 사례는 SARS(치사율 9.6%), MERS(치사율 38%) 정도를 제외하면 거의 없습니다. MERS와 SAS가 치사율이 더 높아 보이지만 SARS-CoV-2는 현재 진행형이며, 언제까지 진행될지 예상할 수 없다는 문제가 있습니다. 신종 코로나바이러스에 대한 백신 및 치료제가 개발되지 않은 상황에선 감염자를 빠르고 정확하게 판별해서 격리하고 치료하는 게 최선의 방법입니다.




진단키트를 제작하기 위해선 목표하는 질병을 일으키는 세균이나 바이러스 등에서 타 병원체와는 다른 유전자 변이를 찾아내야 합니다. 이를 위해선 생물정보 기술을 활용하여 유전자 변이를 더 쉽게 찾아낼 수 있습니다.





인체 내에 바이러스가 들어올 경우 IgM·G(Immunoglobulin M·G) 항체가 형성됩니다. 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)가 몸속에 소량이라도 들어오면 이를 방어하기 위해 IgM·G 항체가 생성됩니다. 이렇게 생성된 항체와 결합하는 항원을 통해서 진단할 수 있습니다. 물론 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)만 특이적으로 검사할 수는 없으나 의심 환자에 대한 광범위한 검사를 진행하여 1차 선별이 가능합니다. 이후 정밀 검사(qRT-PCR등)를 통해 최종 감염 여부를 확인합니다. 1차 선별을 유전자 방식으로만 진행하게 되면 격리된 검사시설과 고가의 장비, 시약, 검사를 수행할 전문 임상 병리사 등이 필요하므로 의심 환자에 대한 광범위한 검사가 어려운 점을 보완할 수 있는 장점이 있습니다.





qRT-PCR은 PCR 증폭 산물을 실시간으로 모니터링하는 해석 방법으로, 기존의 PCR 방법으로는 측정하기 어려운 정확한 정량이 가능합니다. 또한, PCR 원리를 기본으로 하고 있으므로 검출감도가 높고, mRNA 발현 해석이나 SNPs typing 등의 유전자 해석에 요구되는 필수 기술입니다. qRT-PCR의 실험 조작은 비교적 간단하며 종래의 PCR법과 거의 유사하다고 생각하면 됩니다. 현재 qRT-PCR을 기반으로 하는 진단키트에 경우 의삼환자에서 객담(가래)을 추출해 코로나19 바이러스가 있는지를 검사하는 방식으로 정확하게 검출할 수 있습니다. 특히 1~2일 걸리는 배양법에 비해 6시간 가량이면 결과를 도출할 수 있어 신속한 진단에 크게 이바지한 방법입니다.


신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)를 특정할 수 있는 유전자 N, E, S, RdRp, Orf1a, Orf1ab 중에서 최소한 두개 이상의 유전자를 증폭하는 Specific primer를 통해서 감염의 여부를 체크할 수 있습니다.



코로나19 환자에게서 위에 나열된 코로나19 바이러스의 모든 유전자를 완전히 다 검출해서 완벽하게 대조하면 좋겠지만, 그건 오래 걸리고 비용면에서도 효율성이 떨어지기 때문입니다. 그래서 국가마다 검출 유전자는 조금씩 다르지만, 보통은 가장 변이를 덜 일으킬 것으로 보이는 유전자를 최소 2개 이상 검사해서 둘 다 '양성' 반응이 나타나는지를 보고 코로나19 감염 여부를 판단하고 있는 겁니다.
 



신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 감염증의 사례로 알 수 있듯이 진단키트를 활용하여 빠르게 감염자를 선별하고 격리하여 2차 피해를 예방하고 조기에 치료하는 방법이 제일 좋은 방법입니다. 또한, 병원체 (바이러스, 세균 등)은 빠르게 변이되고 돌연변이를 통해 또 다른 질병을 일으킬 수 있으므로 이에 우리는 생물정보 기술을 통해 신속하게 병원체를 연구 및 분석하여 기존의 병원체와의 차이점을 찾아내고 진단키트로 제작하여 대처해야 합니다.
현재 (주)인실리코젠에서는 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 연구를 포함한 감염병 연구를 위해 생물정보 솔루션인 CLC Genomics ProSuite(CLC Genomics Workbench를 포함한 바이러스 및 미생물 NGS 분석 패키지)와 Ingenuity Pathway Analysis(IPA, 유전자 네트워크 분석 솔루션)의 단기 라이선스를 지원하고 있으니 신청하시면 6월 15일까지 사용해보실 수 있습니다.


COVID-19 연구를 위한 단기 라이선스 신청하기


하루 속히 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 감염 확산이 종식되길 바라며, 앞으로 이러한 생물정보 솔루션들의 활용을 통해서 바이러스 및 병원체 발생을 조기에 감지하고 제어하는 공중 보건의 보호에 도움이 되길 바랍니다.

Posted by 人Co

2020/04/26 16:36 2020/04/26 16:36
Response
No Trackback , No Comment
RSS :
https://www.insilicogen.com/blog/rss/response/343



지난해 12월부터 지금까지 전 세계 보건의료를 극심하게 뒤흔들고 있는 SARS-CoV-2의 유전체는 29.8kb 염기서열로 구성되어 있으며 27개의 단백질을 코딩하는 14개의 ORF(Open Reading Frame)를 가지고 있습니다.

이번 SARS-CoV-2 관련한 환자 유래 바이러스 유전체 시퀀싱 데이터는 GISAID(https://www.gisaid.org/) 사이트에서 모두 공개하고 있습니다. 데이터베이스 내 유전체 계통분석 결과를 보면 바이러스 변이가 얼마나 빠르게 생겨나고 어떻게 확산되고 있는지 패턴을 확인할 수 있습니다.

NGS 장비를 활용한 유전체 해독 기술이 지속적으로 발전하면서 이번 COVID-19 사태에서는 메르스 때와는 다르게 감염 환자가 발생하고 늦어도 일주일 안에 유전체 정보가 해독되어 공개되는 것을 볼 수 있습니다.



중국 현장에서는 초소형 유전체 해독 장비인 MinION(Oxford Nanopore)을 활용해 환자 유래 SARS-CoV-2 유전체를 현장에서 24시간 내 시퀀싱 하는 데 활용하고 있으며, 중국 전역에서 발생한 다양한 이 바이러스 유전체 데이터 수백 개가 동시에 계속해서 공개되고 있습니다.



[출처] NANOPORE사의 MinION

MinION을 사용한 시퀀싱은 SARS-CoV-2의 진화를 추적하기 위한 빠르고 효율적인 방법입니다. 실험실 장비에 비용적으로 거의 투자하지 않고 몇 시간 안에 시퀀싱을 수행할 수 있지만, 샘플의 품질이 낮고 다른 출처의 RNA로 오염된 경우가 많기에 생물정보 분석이 굉장히 중요합니다.

이번 블로그에서는 metatranscriptomics 데이터의 한계를 극복하고, CLC Genomics Workbench를 사용하여 Oxford Nanopore MinION 장비에서 시퀀싱된 데이터를 최대한 활용할 수 있는 방법을 안내하도록 하겠습니다.

분석할 데이터는 중국 우한의 해산물 시장에서 처음 폐렴이 발생하였을 때의 샘플을 MinION 장비로 시퀀싱한 메타전사체 케이스입니다[Chan et al., 2020].

환자로부터 가래와 인후에서 면봉을 사용하여 기관지 폐포를 통해 샘플링 하였고, 질병의 직접적인 원인이 되는 바이러스 외의 RNA가 함께 포함되어 있으며, 염기서열에 비의존적으로 무작위 primer를 사용하여 새로운 병원체의 동정이 가능한 SISPA(Single-Primer Amplification) 프로토콜을 사용하였습니다.



CLC Genomics Workbench 20.0 버전 이상에서는 "Long Read Support(Beta)" 플러그인을 지원합니다. 해당 플러그인을 설치하면 Oxford Nanopore의 MinION 장비에서 시퀀싱한 raw 데이터를 import 할 수가 있습니다.



(Long Read Support Plug-in)

직접 시퀀싱한 데이터 외에 공개된 데이터를 기반으로 분석을 진행해보고 싶다면, SRA 데이터베이스를 연결하여 NGS raw 데이터와 메타데이터를 다운로드하여 분석에 사용할 수 있습니다.

분석에 활용한 데이터도 해당 논문 정보를 토대로 가래과 인후에서 면봉으로 채취한 2개의 샘플을 CLC Genomics Workbench내에 연동된 SRA에서 다운로드 해보았습니다.



(Search for reads in SRA)

더불어 변이 분석을 위한 참조 유전체 서열도 우한에서 등록된 최초의 SARS-CoV-2 바이러스 서열(MT135044)을 NCBI search 기능을 이용하여 준비하였습니다.



(NCBI search & Download)

 



해당 샘플에서는 바이러스 서열 농축을 위한 SISPA 프로토콜을 사용하였기 때문에, SISPA adapter를 제거하기 위한 adapter 서열을 별도로 저장한 후 trimming 과정을 통해 시퀀싱된 서열 내에 포함된 adapter를 제거하였습니다.



(
Adapter trim list)

 




Long Read Support 플러그인은 PacBio 또는 Oxford Nanopore 장비에서 생산된 long read의 de novo assembly와 reference mapping 분석을 지원합니다.

Quality 및 adapter trimming 과정을 거친 2개의 시퀀싱 데이터는 중국 우한에서 등록된 SARS-CoV-2 참조 유전체를 기준으로 맵핑을 진행하였고, 전체 시퀀싱된 서열 중에서 샘플 내 코로나 바이러스 서열이 포함되어 있음을 확인할 수 있었습니다.



(
Read mapping)

맵핑 리포트를 확인해보면, 인후 샘플에서는 채취된 샘플 내에 바이러스가 극소량이라 host genome 데이터가 많이 포함되었을 가능성을 나타냅니다.



참조 유전체 서열에 맵핑된 리드들을 기반으로 변이 분석을 수행할 때 CLC Genomics Workbench에서는 3가지 검출 알고리즘을 제공합니다.

이 중 Fixed Ploidy Variant Detection의 경우는 유전체 배수체를 기준으로 germline 변이 분석에 최적화된 알고리즘이지만, 시퀀싱 에러 모델도 함께 적용되어 있으므로 Oxford Nanopore 데이터의 변이 분석에 효과적일 수 있습니다.

분석 결과, 가래 샘플에서는 5개의 변이가 발견되었고, 인후 샘플에서는 3개의 변이가 발견되었습니다.



(Variant calls)

샘플링 날짜를 살펴보았을 때, 참조 유전체 서열인 MT135044의 경우는 2020년 1월 28일이고 MinION 2개의 시퀀싱 샘플은 2020년 1월 11일로 활동적인 발병 상황에서 시간이 지남에 따라 돌연변이를 추적할 수 있음을 나타냅니다.

추가로 해당 변이의 아미노산 변화에 영향을 미치는지도 확인할 수 있으며, 이를 기반으로 단백질 구조에도 변화를 일으키는지 3차원 형태로 확인할 수 있습니다.



(Protein model of a non-synonymous variant)

 



각 샘플별로 참조 유전체 서열에 맵핑된 consensus 서열을 별도로 저장하여 NCBI의 BLAST를 수행하면, 다른 샘플의 SARS-CoV-2 서열들과도 비교할 수 있습니다.

COVID-19 사태로 별도의 BLAST DB도 운영하고 있으므로, 필요 시 local 환경에 Betacoronavirus DB를 다운로드 받아서 Local BLAST 분석도 가능합니다.



(BLAST output hit table)

 



더불어 여기까지 분석은 워크플로우를 만들면 다량의 샘플을 분석할 때 굉장히 효율적으로 쉽게 운영할 수 있습니다.


 
 (A workflow reproducing the bioinformatics pipeline)

이처럼 생물정보 분석은 전체 유전체 수준에서 전염병의 원인이 되는 병원체를 분석하고 비교할 수 있습니다. 더불어 메타 데이터를 이용하여 환자 유래의 바이러스 및 병원체의 유전체 정보를 함께 비교하면 발생 원인을 역으로 추적할 수 있습니다.

현재 (주)인실리코젠에서는 COVID-19 연구를 포함한 감염병 연구를 위해 CLC Genomics ProSuite(CLC Genomics Workbench를 포함한 바이러스 및 미생물 NGS 분석 패키지)와 Ingenuity Pathway Analysis(IPA, 유전자 네트워크 분석 솔루션)의 단기 라이선스를 지원하고 있으니 신청하시면 6월 15일까지 사용해보실 수 있습니다.



하루 속히 COVID-19 감염 확산이 종식되길 바라며, 앞으로 이러한 생물정보 솔루션들의 활용을 통해서 바이러스 및 병원체 발생을 조기에 감지하고 제어하는 공중 보건의 보호에 도움이 되길 바랍니다.



  • Chan, J. et al., A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet, 395(15):514-523
  • Aiping Wu, Yousong Peng, et al., Genome Composition and Divergence of the Novel Coronavirus (2019 nCoV) Originating in China. Cell Host and Microbe, 27
  • GISAID, https ://www.gisaid.org/epiflu applications/next betacov app/

작성 : insilico Lab 김경윤 책임

Posted by 人Co

2020/04/14 10:52 2020/04/14 10:52
Response
No Trackback , No Comment
RSS :
https://www.insilicogen.com/blog/rss/response/342