KO: 게놈 와이드 연관 연구를 통한 탈모 관련 유전자의 발굴
EN: Genome-wide association study of genetic loci associated with baldnes.
tag : GWAS, blad, 탈모, 대머리, GWAS, 맞춤의학, SNP, 유전자 변이
연구목표
탈모는 현재 사회학적으로 볼 때 대단히 중요한 유전 형질 중의 하나이다. 탈모는 사람의 키와 함께 외모 판단의 기준으로 작용하고 있다. 진화론적으로 아무런 이점이 없을뿐더러 오히려 사회적으로 부정적인 영향을 끼친다. 외모적인 핸티캡외도 대머리는 남성에겐 관상동맥 질환과 고혈압, 여성에게는 나낭성난소증후군, 인슐린저항증후군과 연계된 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 진화론적, 사회학적, 질병학적으로도 이롭지 않은 탈모에 관련된 유전자 변이를 탐색하여 이 유전 변이들이 어떤 영향을 끼치는지 이 유전자들이 어떻게 작용하는지, 다른 환경적 및 유전 요인들과의 복합적인 작용을 연구하여 대머리 예방 뿐 아니라 치료에도 이용하고자 한다.
연구내용
탈모는 부계유전으로 알려져 왔지만 최근 연구에 의하면 모계유전의 영향을 받는 것으로 보고 되었다. 또 다른 연구에서 sox21 유전자가 탈모를 일으키는 요인 중의 하나라고 보고 하였다. 현재까지 밝혀진 바로는 최소한 17개의 유전자가 대머리와 연관성이 있는 것으로 밝혀졌지만 어느 유전자가 가장 중요한 유전자인지는 밝히지 못하고 있다. 또한 이들 유전자들이 다른 유전자들과 어떻게 상호 작용을 하는지 모른다. 따라서 이들 유전자 즉,개인의 유전자 변이가 어떠한 영향을 끼치는지 알아볼 필요가 있다. 현재 특정 질병과 연관된 유전적 변이를 찾기 위해 완벽한 세트의 DNA 혹은 게놈을 가로지르는 빠른 마커 탐을 이용한 접근법인 GWAS를 통해 새로운 유전변이를 찾는 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 새로운 유전적 연관이 동정된 뒤에 연구자들은 질병을 검출하고, 치료하고, 방지하기 위한 더 나은 전략을 개발하는데 이러한 정보를 이용할 수가 있을 것이다. 대표적인 유전 형질인 키와 관련한 연구에서도 많은 유전적 변이들이 다른 유전자와 연관에 의해 영향을 끼치고 있음이 밝혀졌다. 따라서 이번 연구에서도 SNP에 기반한 GWAS를 통해 어떠한 유전자들이 서로 연관되어 있는지, 유전자 변이가 존재하는지 알려 줄것으로 본다. 먼저 대머리와 관계된 가계의 조사를 통하여 가계의 정보로부터 유전자의 유입 및 유전되는 형질에 대하여 조사하고 대머리 집단과 그렇지 않은 집단과의 상호 비교를 통하여 조사하고 이를 통계적 분석으로 많은 후보들을 탐지 할 수 있으리라 본다. 그러나 SNP를 기반으로 한 GWAS 연구가 아직까지는 완벽하지 않지만 이미 밝혀진 개인 유전체를 비롯하여 앞으로 진행될 NGS기반의 개인 유전체 연구가 이를 뒷받침할 수 있을 것이다.
기대효과
탈모 및 대머리는 유전적인 영향을 많이 받는 유전력이 강한 요소이다. 그러나 현대에 들어 유전적인 요인, 환경 오염과 인스턴트 식생활 등의 환경적인 요인들과의 복합 작용으로 탈모를 겪는 연령이 점차 낮아지고 있고, 성별에 관계 없이 꾸준히 증가하여 탈모인구가 국내에만 1000만에 이르고 있다. 더불어 탈모 및 대머리가 다른 질환과도 연관이 되어 있기 때문에 탈모 및 대머리를 유발하는 유전자의 기능 및 작용을 일부 나마 밝힐 수 있다면 환경적 탈모 뿐 아니라 유전적인 탈모를 진단, 예방 및 치료제 개발에 많은 도움이 될수 있을 것이다. 만약 이 연구가 치료제 개발로 이루어진다면 엄청난 부가가치로 인해 산업적, 경제적으로 많은 파급효과를 낼 수 있을 것이다.
연구내용
1. 연구의 필요성 (Rationale & background) 가. 배경
대머리는 부계로부터 유전되는 대표적인 다형성형질이다. 대머리는 사회적으로나 유전학적으로나 대단히 중요한 요소로 인식되고 있다. 이제까지는 남성에서는 상염색체 우성유전으로 부모로부터 어느 하나의 대머리유전인자를 받으면 대머리가 되지만, 여성에서는 상염색체 열성유전으로 부모의 어느 한쪽에서만 대머리 유전인자를 받으면 증상이 안나타나는 보인자이고 부모의 양쪽으로부터 인자를 받아야만 대머리가 된다고 알려져 왔다. 하지만 최근에는 다인자적 유전이라 하여 즉 대머리유전인자가 많을수록 대머리가 될 가능성이 높아진다는 설이 인정을 받고 있다. 재미있는 것은 유전적으로 대머리가 될 유전적 소인이 있다해도 사춘기전에 거세하면, 대머리가 되지 않는다. 즉 정소에서 만드는 남성호르몬인 안드로젠이 없으면 대머리가 되지 않는다는 것이다. 내시인 환관은 대머리가 없다. 하지만 다시 이 환관에게 경구용 남성호르몬인 테스토스테론을 먹이면 수개월내에 대머리가 된다. 즉 유전일지라도 대머리가 되기 위해서는 안드로젠호르몬이 꼭 필요하며, 그래서 남성형 탈모증을 '안드로젠탈모증'이라 한다. 그 외에도 입시, 유학, 군생활, 직장에서의 과도한 스트레스가 탈모의 주요한 요인으로 작용한다. 이밖에 잦은 퍼머나 염색, 무스나 스프레이의 사용으로 모근이 약해져 탈모가 일어나기도 한다. 실제 임상에서 문진을 통한 통계로 보면 아버지를 포함하여 친가의 가족력이 있는 경우가 약 60%, 외가에서는 20%, 양측이 10%, 뚜렷한 연관이 없는 경우가 10%정도이다. 여성도 그 빈도는 적지만 여성형 안드로젠탈모증이 있다. 주로 남성과 다른 점은 앞 이마는 잘 유지되며, 주로 정수리부위의 머리카락이 얇아지고 짧아지는게 특징이므로 대머리라고 표현하기보다는 탈모증이란 표현이 알맞다. 여성에서는 안드로젠호르몬의 양이 적어서 심하지 않은 것으로 생각되며, 그래서 남자처럼 이마가 벗겨지며 완전한 대머리로 발전하는 일은 거의 없다. 원인으로는 남성처럼 유전과 남성호르몬이 모낭에 영향을 미쳐 일어난다. 그러나 남성에서는 남성호르몬의 분비가 대개 정상 수준이지만, 여성에서는 내분비기관 즉 부신이나 난소의 이상으로 인한 호르몬의 과다 분비나 약물복용이 원인이 되는 경우가 많다. 이처럼 유전학적 원인 뿐 만 아니라 호르몬 및 환경적 요인으로 탈모가 발생하고 대머리로 발전하게 된다.
나. 탈모와 사회 생활
탈모는 현대 사회생활에 있어서 대단히 중요한 요소이다. 현대 사회에 접어들면서 외모가 자신을 표현하는 수단으로 표현되기 때문에 여성뿐 아니라 남성에게도 외모 가꾸기는 필수요소가 되었다. 미팅시 도저히 용납이 안되는 남성의 외모 중 대머리가 30%에 육박하며 1순위를 차지했다. 이처럼 대머리는 사회생활을 하면서 심리적인 요소 뿐만 아니라 실제로도 패널티로 작용하는 중요한 요소이다. 그러나 과학자들은 어째서 대머리라는 형질이 유전적으로 계속 활성화 되고 있는지 설명하지 못한다. 대머리는 진화론적으로 이점이 거의 없기 때문이다. 대머리는 오히려 사회적으로 부정적인 영향을 끼친다. 외모적인 핸티캡 외에도, 대머리는 남성에겐 관상동맥 질환과 고혈압, 여성에겐 나낭성난소증후군, 인슐린 저항성 증후군 질환과 연계된 것으로 알려져 있다. 따라서 이처럼 사회적으로 부정적이고 질병과도 연관이 있는 대머리 관련 유전자가 유전학적으로 다른 유전자들과의 상호 작용이 있는지를 알아볼 필요가 있다. 또한 대머리를 유발하는 유전자를 발굴함으로써 이에 따른 기능, 작용, 대사 경로 등을 탐색함으로써 대머리를 근원적으로 치료할 수 있는 방법을 연구하고자 한다.
2. 연구목표 및 내용 (the purpose of study and contents)
가. 탈모와 관련한 선행 연구
탈모와 관련이 있는 유전자는 그 동안 기업 및 연구소에서 꾸준히 진행되어왔다. 선행연구에서 sox21 유전자가 탈모를 일으키는 요인 중의 하나라고 밝혔다. 이 유전자가 부족한 사람의 머리카락은 가늘고 힘이 없는 것으로 조사됐다. 또한 두피에 불필요한 피부조직을 만들어 탈모를 유발하는 것으로 밝혀졌다.(Kiso M et. al, 2009) 로레알 연구소에 따르면 "대머리는 머리카락 유전자의 스위치가 꺼지기 때문에 생기며 유전성이 매우 강하다. 적어도 17개의 유전자가 대머리와 연관성이 있는 것으로 밝혀졌지만, 어느 유전자가 가장 중요한 원인인지는 아직 밝히지 못했다." 라고 한다. 또 2008년 10월 13일 Nature Genetics-online edition에 대머리에 관한 6개의 새로운 유전자가 발견되었다고 보고되었다. 남성의 대머리에 관련된 이 6개의 다른 유전자가 한 염색체 위에 존재하는 것으로 보고되었다. 대부분의 남성들은 자신이 대머리인지 아닌지 알고 있다. 그러나 초기에 이를 진단하는 것은 새로운 치료방법으로 이어질 수 있다. 이 새로운 방법은 머리가 빠지기 전에 시행되는 것으로, 머리가 빠지고 나서 행해지는 시술보다 더욱 효과적일 것이다. 이 새로운 발견은 두 개의 연구에 의해 발견되었는데, 모두 3400명의 남성과 여성이 참여하였다. 연구원들은 남성형 대머리가 있는 사람들과 없는 사람들의 유전자를 비교, 분석하였는데, 그중 하나의 연구에서는 어떤 유전자가 안드로겐 리셉터 유전자상에 있는 다른 대머리 관련 유전자와 비교하여 남성형 대머리의 형질을 7배나 더 많이 나타냈다고 한다. 연구에 따르면 남자 7명중 한명은 이 두 유전자를 모두 가지고 있다고 한다. 이 연구는 다른 5개의 남성형 대머리와 관련된 유전자들이 같은 염색체상에 존재한다는 것 또한 밝혀졌다. 영국과 미국에서 발표된 연구자료에 의하면 탈모는 부계유전될 것이라고 대부분 알고 있지만 실제로는 모계유전의 가능성이 더 높다고 밝혀졌다. 연구결과 아버지가 탈모인 경우 아들이 남성형 탈모증에 걸릴 위험률은 탈모 가족력이 없는 사람에 비해 2.1배 높았다. 반면 드물지만 어머니가 탈모증을 겪는 경우 아들이 탈모가 될 확률은 7.5배에 달해 아버지쪽보다 3배 이상 높은 것으로 나타났다. 또 친조부가 탈모일 경우 탈모 위험률이 1.5배인 반면 외조부가 탈모 일 때는1.7배로 더 높았다. 부계와 모계 양쪽 모두 탈모가 있을 경우는 위험성이 7.9배 높았다.
나. 탈모와 유전체학
앞선 이런 모든 연구에서 탈모와 관련이 있는 유전자를 규명하였지만 아직 어떤 유전자가 그 기능을 담당하는지 유전자간의 상화작용에 대해서는 밝히지 못했다. 탈모는 특정 유전자 하나에 의한 것이 아니라 다인적 요소에 의해서 나타나게 된다는 것이 통설이다. 따라서 탈모와 관련 유전자들의 기능을 규명하고 이들이 안드로젠 등과 어떻게 관련되어 있는지 그 작용을 알아볼 필요가 있다. 좀 더 미래에는 게놈 전체에 대한 탐색 비용과 효율면에서의 개선 및 다른 혁명적인 기술 개발 이후, 건강진단전문가가 특정 질병에 대한 위험도에 대한 개인화된 체질을 고려하여 예방범을 설계할 수 해줄 것이다. 게다가 환자가 질병에 노출되었을 경우 이러한 정보는 특정 환자에게 고효율 및 저부작용적인 치료법 선택에 이용될 수 있을 것이다. 지금까지 GWAS 기술을 이용하여 상당한 성공들을 보고해 왔다. 예를 들면 2005년, 3개의 독립적인 연구에서 맹안의 일반적인 형태는 보체인자 H의 유전자의 변이와 연관이 있음이 밝혀졌다. 이전에는 이러한 염증이 이러한 형태의 맹안의 유의하게 기여할 것이라고 거의 생각되지 않았었다. 비슷하게도 2형당뇨, 파킨슨병, 심부전, 비만, 크론병 및 전립선암 뿐만 아니라, 항우즐증의 약의 반응에 영향을 주는 유전적 변이를 GWAS를 이용한 연구를 통해 보고되고 있다. 특히 예로부터 대표적인 유전형질의 한 형태로 인식되어 온 사람의 키에 대한 연구가 최근 보고되었다. Weedon 등이 연구한 바에 따르면 HMGA2 유전자에서 성인 키에 대한 관련된 연구를 진행하였고, Sanna 등은 GDF5-UQCC에서 키와 관련된 SNP를 진행하였다. 특히 Lettre 등은 Genome-Wide scale을 통해서 15,000 개 이상의 데이터에서 메타 분석을 통해 12개의 후보 유전자들을 발굴했다. 앞의 연구에 따르면 사람의 키는 80% 이상이 유전적 요소에 의해서 결정이 된다고 한다. 성인의 키는 다양한 환경의 영향 및 개인적인 특성으로 인한 몇몇 유전자가 복합 작용을 하는 대표적인 다인성 유전 형질이다. 뿐만 아니라 키와 관련된 유전자들 중 일부는 실제 질병과도 연관이 있음이 밝혀졌다. 이러한 연구들은 실제 GWAS를 통해 얻어진 결과들이다. 성인의 키와 마찬가지로 대머리 및 탈모는 대단한 유전력을 가지고 있다. 부모가 대머리이면 자식이 대머리일만큼 유전력이 강하다. 그러나 아직 대머리를 유발하는 정확한 원인에 대해서는 아직 밝혀지지 않고 있다. 따라서 이러한 대머리를 유발하는 유전자를 동정하기 위해서 성인의 키와 관련된 유전자를 동정했던 경우와 같이 GWAS를 통한 연구를 진행할 수 있을 것이다. 더불어 GWAS에 대한 연구가 활성화된 이후로 현재까지 꾸준히 진행되고 있다. 앞선 키와 관련된 연구뿐만 아니라 다양한 질병에 대한 연구가 진행되고 있다. 아직은 선행연구에서 밝혀진 유전자들이 대머리에 관련하는지의 여부와 또 어떻게 영향을 주는지에 대하는 것은 아무도 모른다. 이를 알아내는 것이 새로운 치료법을 만들기 위해 반드시 필요한 것이다.
3. 연구의 추진전략 및 방법 (strategy and methods)
가. SNP 기반의 질환 유전자 탐색
특정 질병과 연관된 유전적 변이를 찾기 위해 완벽한 세트의 DNA 혹은 게놈을 가로지르는 빠른 마커 탐색을 이용한 접근법인 GWAS를 통해 새로운 유전 변이를 찾는 연구가 한참 진행되고 있다. 이러한 새로운 유전적 연관이 동정된 뒤에 연구자들은 질병을 검출하고, 치료하고, 방지하기 위한 더 나은 전략을 개발하는데 이러한 정보를 이용할 수가 있다. 2003년 인간 유전체 프로젝트과 2005년 HapMap 프로젝트들이 종료됨과 동시에 일반적인 질병들에 대한 유전적인 기여들을 찾을수 있게 되었다. 이러한 도구에는 참조 인간 유전체 서열, 인간 유전자 변이 지도 등과 같은 전산화된 데이터베이스들과 질환의 질병에 기여하는 유전자 변이를 찾기위한 빠르고 정확하게 전(whole) 지놈을 분석할 수 있는 기술들이 포함된다. GWAS로부터 얻어지는 정보들은 맞춤의학 시대를 위한 배경을 제시해 줄 것이다
나. GWAS, 전장유전체 연관 분석
기본적으로 GWAS(genome wide association study)에서는 common disease-common variant(CDCV) 가설을 기반으로 연구가 진행된다. 즉, 일반적으로 인류 집단에 광범위하게 퍼져있는 질병(common disease)의 원인은, 마찬가지로 인류 집단의 유전정보 전체에서 광범위하게 발견되는 변이(common variants)가 원인이라는 가설을 기반으로 하고 있다. 그 과정은 간단히 설명하자면, 질병에 걸린 사람과 그렇지 않은 사람을 나누어 질병에 걸린 사람들에게서 통계적으로 유의하게 나타난 유전변이를 찾아 이는 질병에 관련한 유전변이이며 이 변이를 가지고 있다면 그렇지 않은 사람에 비해 해당 질병에 대해 ~배 위험도를 지닌다고 말하게 된다. 이런 변이를 발굴하기 위해 첨단 기술 및 통계적 분석 방법 등을 이용하여 많은 연구를 시행하였다. 이의 기본 바탕은 SNP와 같은 유전적 다형성을 통한 연관성 연구에서 보다 효율적이고 설득력을 제공하는 것은 여러 염색체 내의 다양한 SNP을 대상으로 각각의 빈도를 비교하는 것보다는 동일한 염색체상의 서로 다른 부위에 존재하는 연관된 대립인자를 집단으로 묶어서 분석하는 것이다. 이를 일배체형 분석 (haplotype analysis)이라고 한다. Haplotype의 정의는 일반적으로 인간의 DNA에는 두 개의 대립인자가 쌍을 이루어 존재하는데 이 쌍을 이루는 각각의 대립인자 상에서 부모로부터 전달 받은 한 방향의 특정한 타입을 말한다. 즉, 오래전 조상으로부터 그 다음 세대로 유전 정보가 교환될 때 블록 단위로 다량의 DNA 서열이 파괴되지 않고 그대로 전해져 내려오는데, 이때 그 블록 내의 DNA서열을 말한다. 이러한 haplotype 분석은 동일한 유전자 내 또는 염색체 상의 다형성 가운데 상호 연관 불평형 (linkage disequilibrium; LD) 관계에 있는 인자들 간의 모음을 분석하는 것으로 복합형질 질환과의 연관성 연구에서의 단일 SNP 간의 분석과 비교해 볼 때 그 통계적 power와 해석력이 매우 높다고 하겠다. 즉, 유전형 조사에서 나타난 SNP data는 다수의 SNP들을 조합하여 다양한 haplotype을 만들고 이때 결정된 각각의 haplotype은 하나의 독립된 genetic marker로 이용될 수 있다. 현재까지 알려진 SNP의 수가 매우 많아 이들을 genotyping하여 특정 분석을 할 경우, 시간과 비용의 비효율 및 비경제성으로 인하여 특정 haplotype block 내에서 그 haplotype을 대표할 수 있는 "tagging SNP"을 선별하여 분석에 이용하면 SNP의 수는 최대한 감소시키면서도 분석 resolution에 유의한 변화 없이 전체 집단의 SNP의 분포 및 빈도 차이 등의 유전변이 양상을 최대한 분석할 수 있다.
다. SNP genotyping tools
SNP genotyping 방법은 매우 다양하며 각각의 방법은 고유한 분석원리를 적용하여 이용하고 있다. SNP genotyping 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데 이는 분석 규모에 따라 구분된다. 첫 번째는 비교적 작은 규모의 sample size를 대상으로 typing하는 방법으로 PCR-RFLP, SSCP, TaqMan, Pyrosequencing, Invader, SNaPShot, MassArray 등이며 두 번째는 최근 개발되어 사용되는 대용량 시료분석 시스템으로 SNPlex, BeadArray 및 Illumina와 Affymetrix의 대용량 SNP chip 등이다.
① TaqMan Assay
TaqMan 방법은 Tap polymerase의 5'-nuclease 성질을 이용하는 방법으로, 반응에는 한 쌍의 TaqMan probe와 한 쌍의 PCR primer가 사용된다. 5'-말단에는 reporter dye가, 3'-말단에는 quencher dye가 공유결합 되어있는 TaqMan probe를 이용하며, 다형성 부위 (polymorphic site)와 TaqMan probe간의 match와 mismatch의 차이를 형광물질을 이용하여 감별하는 방법이다. TaqMan probe에 reporter dye와 quencher dye가 모두 결합되어 있을 대는 reporter dye가 quencher에 의해 빛을 발하지 못한다. 그러나 SNP이 위치한 부위와 상보적으로 완전히 일치하는 TaqMan probe는 PCR의 annealing 단계에서 결합되고, extension 단계에서 Taq 중합효소의 5'-nuclease 활성도에 의하여 5'-말단부의 reporter dye (FAM 또는 VIC)가 quencher dye로부터 분리되어 고유한 형광을 나타낸다. Probe가 표적 (target) SNP과 mismatch되면 probe가 template로부터 떨어져 나가기 때문에 더 이상의 반응이 진행되지 않는다. 이 방법은 SNP 이외에도 아주 작은 염기서열의 삽입 (insertion)이나 결실 (deletion)도 분석할 수 있다. TaqMan 방법은 실험방법이 매우 간단하고 정확한 정량이 가능하지만 probe 비용이 비싸며 최적화를 필요로 한다.계에서 Taq 중합효소의 5'-nuclease 활성도에 의하여 5'-말단부의 reporter dye (FAM 또는 VIC)가 quencher dye로부터 분리되어 고유한 형광을 나타낸다. Probe가 표적 (target) SNP과 mismatch되면 probe가 template로부터 떨어져 나가기 때문에 더 이상의 반응이 진행되지 않는다. 이 방법은 SNP 이외에도 아주 작은 염기서열의 삽입 (insertion)이나 결실 (deletion)도 분석할 수 있다. TaqMan 방법은 실험방법이 매우 간단하고 정확한 정량이 가능하지만 probe 비용이 비싸며 최적화를 필요로 한다.② GoldenGate Assay
미국 Illumina 社의 GoldenGate® genotyping assay는 genomic DNA를 template로 사용하여 primer extension과 증폭 단계를 통하여 많은 수의 multiplexing (1,536-plex)이 가능한 SNP genotyping 방법이다.SNP genotyping을 위해 template DNA는 biotin으로 labeling하여 잉여의 hybridization solution과 streptavidin conjugated paramagnetic particles (SP-PMPs)로부터 정제된다. 정제된 DNA template에 세 가지의 oligonucleotides (oligos)가 첨가되는데 두 가지의 oligo 는 SNP site의 각각의 대립유전자형에 특이적인 Allele-Specific oligos (ASOs)이고 다른 하나의 oligo는 SNP site의 몇 base pair downstream에 hybridization되는 Locus-Specific Oligo (LSO)이다. oligo hybridization 후에 hybridization 되지 않은 oligos는 제거되며, allele-specific extension 후 ligation 반응이 수행된다. Ligation된 산물을 형광물질로 표지된 universal PCR primers P1 (Cy3), P2 (Cy5)와 P3 로 PCR 증폭시킨 후에 single-strand로 만든다. single-stranded, dye-labeled DNA는 unique address sequences를 통해 상보적인 bead type (Array Matrix 또는 BeadChip)에 hybridization되고 형광물질의 signal을 읽어 자동으로 genotype을 결정하게 된다. GoldenGate assay는 1,500여 개까지의 SNP를 동시에 genotyping할 수 있는 multiplexing assay가 가능하고 비교적 저가의 비용으로 정확하게 typing은 가능하지만, 모든 SNP sites에 대하여 분석이 가능한 것은 아니다.③ Affymetrix GeneChip Assay
최근 Affimetrix 社에서 수십만 개의 SNP을 chip-based로 하여 동시에 genotyping할 수 있는 시스템을 개발하여 상용화 하였다.이 분석방법을 간략히 소개하면, genomic DNA는 제한효소 (StyI 및 NspI)로 우선 절단되고 생성된 모든 단편은 크기에 관계없이 4 bp 돌출부 (overhang)를 인지하는 adaptor에 결합하게 된다. Adaptor가 붙여진 DNA 단편을 adaptor의 염기서열을 인지하는 primer로 증폭되며, PCR 증폭조건은 200~2,000 bp 크기의 단편을 선택적으로 증폭시키기 위해 최적화되어 있다. 증폭된 DNA는 이후에 조각 (fragmentation)으로 잘려진 후에 표지 (labeling)되어 GeneChip Array에 hybridization된다. Array에는 A 대립유전자 염기서열과 B 대립유전자 염기서열에 perfect match로 대응되는 25-mer probe가 합성되어 있으며 결합의 특이성을 결정하기 위하여 각각의 25-mer 중앙에 위치하는 single base pair mismatch도 포함되어 있어 genotyping의 정확성을 점검하는데 사용되고 있다.최근에는 복합형질 질환의 연관성 연구에 Affymetrix 社의 500K SNP chip (약 50만 개 이상의 SNP QNSTJR 가능)을 이용하여 genome-wide SNP genotyping을 수행하여 두 군 간의 유전체 상의 유전적 변이 양상을 찾아낼 수 있다. Affymetrix GeneChip Assay는 자동화되어 수행하기 간편하고 대량의 multiplexing 능력을 보유하고 있기 때문에 genome-wide SNP genotyping이 가능한 장점이 있으나 SNP chip에 올려진 SNP sites가 제한효소에 의해 특정 부위의 SNP sites만이 선별되어 있고 연구자가 개별적인 필요성에 의해 자체 제작하기는 매우 어려운 단점을 가지고 있다. 최근에는 Genome-wide SNP genotyping chip을 이용하여 유전체의 증폭 (amplification) 또는 결실 (deletion)에 의한 유전자의 복제수 변이 (copy number variation) 및 이형접합체의 분포 상황 등을 조사할 수 있게 되었다. 이러한 추가적인 분석기능은 특히 유전체 상에서 많은 변화를 유발하는 암 세포의 유전적 변화에 대한 특성규명에 유용하게 활용되고 있다. 이와 같은 최신 SNP genotyping 분석기술을 이용하여 분석하게 된다.
라. 패밀리 기반의 유전 변이의 탐색
앞서 언급한 바와 같이 대머리는 가계 중심으로 그 유전력이 상당히 강하다. 예전에는 부계로만 유전되는 것으로 알려졌지만 선행 연구에서 및 경험상으로 미루어보아도 모계 유전도 상당히 강하다. 따라서 현재 대머리가 빈번히 발생하는 가계(제안자)에서 처럼 원래 대머리 관련 가계가 아니었지만 외가로부터 유입된 유전자의 영향으로 대머리가 발생하는 집단의 가계 조사를 실시하고 이를 바탕으로 각 가계 구성원의 유전변이를 탐색한다. 이에 대머리를 유발하는 유전변이 및 관련 유전자를 탐색하여 어떠한 유전자가 변이를 일으켰는지 살펴본다면 그 원인 규명에 많은 도움이 될 수 있을 것이다. 또한 대머리는 특정 질환과 같이 그 표현형이 명확하다. 앞선 연구에서처럼 대머리를 유발하는 유전자를 가진 개인과 그렇지 않은 개인 즉 두 집단의 구분이 명확하기 때문에 두 그룹에 대하여 개인간의 유전 변이를 살펴본다면 이 또한 대머리 질환 관련 유전적 변이를 찾는데 많은 도움이 될 것이다.
마. SNP 통계 분석
유전체 연구를 통해 얻어진 자료는 분석 내용에 따라 적합한 통계분석 방법을 활용하여 해석함으로써 연구 결과가 갖는 biological significance를 찾아야 한다. 연관성 연구에 활용되고 있는 통계분석 방법은 아래 표 와 같다.
분석 내용 |
분석 방법 |
통계적 분석방법/알고리즘 |
SNP의 세대간 allele 분포가 동일한 집단인지 분석 |
HWE test |
χ2 test |
상관성이 높은 SNP 군 추정 |
LD 분석 및 blocking |
LD coefficient |
가능한 haplotype 추정 |
Haplothpe estimation |
EM algorithm |
SNPs 및 haplotype과 환자. |
Regression Analysis |
Logistic regression |
환자군과 대조군을 구분할 수 있는 대표 SNP추출 |
빈도분석 |
Cart algorithm |
다른 Gene에 위치한 SNPs 과 환자. 대조군의 연관성 분석 |
Gene-Gene Interaction |
χ2 test,OR, PRR 그리고 CI |
바. 연관성 연구 접근 방법
과거 대부분의 연관성 연구는 질병 후보유전자 1-2개를 선발하여 그 유전자 내에 존재하는 소수의 유전적 변이를 이용하여 질병과의 관련성을 찾는 시도를 해왔으나 현재에는 SNP chip을 이용하여 인간유전체에 널리 퍼져 있는 대량의 SNP을 조사하는 이른바 genome-wide association study (GWAS) 방법이 보편화되고 있는 추세이다. 그러나 매우 많은 수의 SNP을 사용하는 분석에 있어서는 임의적인 오류 (random error)의 발생률도 증가하게 되는 단점이 있다. 따라서 genotyping technique의 발전과 함께 새로운 분석 접근기법의 개발이 수반되고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서 "다단계 접근방법 (multi-stage approach method)"을 활용을 한다.
사. 개인 유전체학의 접목
하지만 common 한 질병이라는 것이 단순히 유전변이라는 원인 하나만으로 발생하는 것은 아니며, 지난 5년간 미국의 NIH와 영국의 Wecolme trust 등에서 막대한 연구비를 투자한 GWAS 연구를 수행하여 엄청난 결과를 얻었지만 그에 반해 실제 질병에 대한 치료나 예방에 획기적인 방법은 아직 없는 현실이다. 그렇다면 실제 GWAS를 이용하여 밝혀진 유전변이 정말 실제 임상에서는 쓸모 없는 것인가? 그러나 실제 문헌을 통한 질병 관련 유전변이의 선택이나 유전변이들의 점수를 매긴 정보를 비교해보자면 전체적으로 Genotype score 가 높은 사람, 즉 특정 질환이나 질병과 관련된 유전변이의 개수가 많으면 많은 사람일 수록 시간이 지남에 따라 실제 질환에 스코어가 낮은 사람에 비ㅇ해 더 쉽게 질환에 노출되는 경향을 보인다는 것을 보고하였다. 비록 각각의 유전변이가 필연적으로 질병의 발생에 적은 영향을 미치지만 이는 질병의 진단이나 예측에 다수의 변이 결합이 유용할 수 있다고 볼 수 있다. 따라서 이를 바탕으로 좋은 측면에서 보자면 위와 같이 유용하다고 할 수 있지만 문제는 존재하게 된다. GWAS가 실효성을 그두지 못하는 이유가 기본적으로 인구집단에서 광범위하게 발견되는 유전변이를 가지고는 찾을 수 없는 드문 변이가 질병의 원인일 수도 있기 때문에 그 대안으로 Next generation sequencing이 이러한 한계를 극복하는데 일조 할 수 있 을 것이다. 그러나 NGS는 아직 보편적인 연구에 이용하기에는 비용과 노력이 많이 소요된다. 그러나 다행히 현재 그 기술이 꾸준히 발전하고 비용도 점차로 줄어드는 추세이다. 다행스럽게도 우리가 잘 알고 있는 크레이그 벤터처럼 대머리 유전자를 가진 사람의 유전체가 공개되어 있고 이를 대머리와 거리가 먼 사람들의 전방위 비교를 통하여 좀 더 유용한 정보를 찾아 볼 수 있을 것이다. 그러나 이는 시간과 노력이 많이 들기 때문에 일차적으로 SNP 기반의 GWAS를 통하여 대머리와 관련이 있는 유용한 유전자를 발굴한 후에 이들을 실제 유전체 레벨에서 비교한다면 좀 더 유용한 정보를 확보 할 수 있으리라 본다.
4. 연구결과의 활용방안 및 기대성과(expected contributions)
대표적인 유전적 형질인 성인 키에 대해 연구가 GWAS를 통해 연구되어지고 있다. 사람의 키는 특히 국내에서는 현대 사회의 면모를 고스란히 보여주고 있다. 최근 이슈화되었던 성인 키에 대한 언급이 있을 정도였다. 키와 함께 대머리는 부계로부터 유전되는 대표적인 다인성 형질이다. 대머리는 사회적으로나 유전학적으로나 대단히 중요한 요소로 인식되고 있다. 대머리 관련 유전자를 가지고 있는지가 국내에서는 초이슈화의 대상이 되고 있다. 대머리가 진화론적으로 아무런 이점이 없을 뿐더러 오히려 사회적으로 부정적인 영향을 끼친다. 외모적인 핸티캡 외에도, 대머리는 남성에겐 관상동맥 질환과 고혈압, 여성에겐 나낭성난소증후군, 인슐린 저항성 증후군 질환과 연계된 것으로 알려져 있다. 성인 키를 통한 연구에서 키에 영향을 미치는 유전자 중 일부는 다양한 질환과도 연관이 있음이 밝혀졌다. 대머리 또한 남성에게는 동맥관계 질환이나 고혈압, 여성에게는 나낭성난소증후군, 인슐린 저항성 질환과 같은 질병과 연관이 있다. 이처럼 진화론적, 사회학적, 의료적으로 보더라도 이롭지 않은 대머리에 관련된 유전자를 동정함으로써 이 유전자들이 어떻게 작용하는지, 다른 환경적 및 유전적 요인들과의 복합적인 작용을 연구함으로써 대머리 예방 뿐아니라 치료에도 이용할 수가 있다.
대머리에 영향을 미치는 후보 유전자들을 선발하고 이에 대한 실험을 통해 그 기능 및 기작을 증명한다면 대머리 예방 및 치료제 개발에 중대한 요인으로 작용할 수 있다. 현재 외국의 피부 및 모발 연구소에서도 본격적으로 대머리와 관련된 연구가 진행되고 있다. 실험 결과가 만족할 만한 결과가 나온다면 이들 모발관련 회사와의 연계를 통해 좀 더 본격적으로 진행할 수도 있을 것이다.
그러나 GWAS를 통해 이루어진 연구는 확률에 의한 유전적 변이를 동정하는 수준에 그치고 있다. 그러나 이미 국내외로도 인간 개인에 의한 시퀀싱 프로젝트가 진행되고 있다. 이미 대머리의 유전형질을 보유한 크레이그 벤터와 그 외 다른 개인 간의 비교 분석을 통해 대머리 관련 유전자 변이 수준을 확인할 수 있을 것이다.
현재 유전적인 요인, 환경오염과 인스턴트 식생활 등의 복잡한 요인으로 탈모를 겪는 연령이 잠차 낮아지고 있고, 성별에 관계없이 증가하고 있어 탈모인구가 1000만에 달하고 있다. 탈모는 진행상황에 따라 치료법이 나뉘어지는데 초기에는 먹거나 바르는 약물을 처방하거나 모발의 생장을 돕는 약물을 주사하고 탈모가 진행 후 모근이 사라질 경우에는 '모발이식'이 최선의 방법이다. 남성호르몬의 영향을 받지 않는 뒷 머리카락을 이용하여 빠져있는 부분을 메우는 방법이다. 그러나 이러한 수술에는 부작용 및 많이 비용이 들기 때문에 쉽지 않다. 그러나 이러한 연구를 통해 환경적 탈모 뿐 아니라 유전적인 탈모를 근본적으로 치료하기 위해서는 근본적인 치료제 개발이 이루어진다면 국내 뿐 아니라 해외 시장에서도 엄청난 산업적, 경제적 파급 효과를 기대할 수 있을 것이다.
Baldness와 연관관계를 가지고 있는 protein 및 functional class들을 PathwayStudio로 간단하게 분석하였다. 이 분석을 검토해 볼 때 Bladness에 다양한 유전자들이 관여한다는 것을 확인할 수 있다.
