Reference Set을 User Dataset으로 설정하기
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2026. 10. 07 - Q1. Reference set이란 무엇인가요?Reference set은 IPA가 통계를 계산할 때 기준으로 삼는 "전체 유전자 집합(실험에서 검출될 수 있었던 유전자 전체)"입니다. Pathway 분석의 Ratio와 p-value(Fisher's exact test)는 모두 이 집합을 기준으로 계산됩니다.Core Analysis에서 선택할 수 있는 Reference set은 다음과 같습니다.Ingenuity Knowledge Base: IPA 지식베이스에 등록된 모든 분자를 전체 유전자 집합으로 사용합니다. 실험에서 측정하지 않은 유전자도 포함됩니다.User Dataset: 업로드한 데이터셋에 포함되어 IPA에 mapping된 분자만 전체 유전자 집합으로 사용합니다.QIAGEN은 실제 측정 가능했던 유전자 집합과 가장 가까운 전체 유전자 집합을 쓰는 것을 권장합니다. 따라서 대부분의 실험에서는 User Dataset 설정이 통계적으로 더 적절합니다.Q2. Reference set을 User Dataset으로 설정하려면 어떻게 하나요?Core Analysis 설정 화면의 General Settings에서 Reference set을 User Dataset으로 바꾸면 됩니다. 메뉴 이름과 위치는 IPA 버전에 따라 조금 다를 수 있습니다.측정된 전체 유전자 목록이 담긴 데이터셋을 업로드 합니다. 유의한 유전자만 걸러낸 파일이 아니어야 합니다(Q5 참고). 업로드한 데이터셋을 선택한 뒤 New Core Analysis를 시작하고, 사용할 측정값 컬럼(Expr Log Ratio, p-value, FDR 등)을 지정합니다.General Settings에서 Reference set(p-value 계산에 사용할 유전자 집합) 항목을 User Dataset으로 선택합니다.Cutoff 설정에서 분석에 포함할 유전자 기준(예: FDR < 0.05, |log2 fold change| > 1)을 지정합니다. 이 cutoff를 통과한 유전자만 분석 대상(analysis-ready molecules)이 되고, 업로드한 데이터셋이 전체 유전자 집합이 됩니다.나머지 설정을 확인하고 분석을 실행합니다.Q3. 같은 데이터셋인데 설정에 따라 결과가 왜 달라지나요?Reference set이 바뀌면 Ratio의 분모와 p-value 계산의 기준이 함께 바뀌기 때문입니다.Pathway의 Ratio는 다음과 같이 계산됩니다.(cutoff를 통과한 분자 중 해당 pathway에 속하는 수) / (Reference set 안에서 해당 pathway에 속하는 분자 수)Knowledge Base를 쓰면 분모는 IPA가 정의한 pathway 구성원 전체입니다. User Dataset을 쓰면 그중 업로드한 데이터셋에 실제로 있는 분자만 분모에 남습니다. 분자는 두 설정에서 같습니다.아래는 같은 데이터셋을 두 설정으로 분석한 Nucleosome assembly pathway 결과입니다.항목Ingenuity Knowledge BaseUser DatasetRatio16/71 (0.225)16/39 (0.41)z-score-2.5-2.5p-value1.21E-061.97E-08같은 16개 유전자가 겹쳐도, 측정 가능했던 39개 중 16개라는 비율이 더 높기 때문에 p-value가 더 유의해졌습니다. 이 변화는 pathway마다 다르게 일어나므로 pathway의 유의성 순위도 바뀔 수 있습니다. 반면 z-score는 겹치는 유저자들의 발현 방향으로 계산되므로 대개 그대로입니다.Q4. Pathway 분자 중 일부가 분모에서 빠진 이유는 무엇인가요?빠진 분자는 업로드한 데이터셋에 처음부터 없었던 유전자입니다. 측정되지 않았거나, 분석 전 처리 과정에서 제외된 경우입니다.예를 들어 Nucleosome assembly처럼 히스톤 유전자가 많은 pathway는 RNA-seq에서 분자가 크게 줄어드는 경우가 많습니다.실험·정량·분석 단계 중 어딘가에서 충분히 검출되지 못해 업로드한 데이터셋에 포함되지 않았을 수 있습니다.발현량이 낮으면 low-count 필터링이나 DESeq2의 independent filtering(padj = NA)으로 제외될 수 있습니다.유전자 ID가 IPA에 mapping되지 않으면 데이터셋에 있어도 전체 유전자 집합에서 빠집니다.어떤 유전자가 빠졌는지는 업로드한 원본 파일과 pathway 구성 유전자 목록을 비교해 확인할 수 있습니다.Q5. User Dataset으로 설정할 때 반드시 확인해야 할 점은 무엇인가요?업로드한 파일이 DEG만이 아니라, 실험에서 측정된 전체 유전자 목록이어야 합니다. User Dataset 설정은 이 전제에서만 올바른 결과를 줍니다.유의한 유전자만 미리 걸러서 올린 파일을 Reference set으로 쓰면, 전체 유전자 집합이 "이미 유의한 유전자"로만 채워집니다. 이 경우 Fisher's exact test의 기준이 왜곡되어 p-value를 해석할 수 없게 됩니다. 이런 설정은 통계적으로 잘못된 것입니다.올바른 방법은 다음과 같습니다.측정된 전체 유전자(예: 발현 필터를 통과한 모든 유전자)와 그 측정값(log ratio, p-value, FDR 등)을 업로드합니다.Reference set을 User Dataset으로 지정합니다.IPA의 cutoff 설정(FDR, log ratio 등)으로 분석할 유의 유전자를 걸러냅니다.이미 DEG만 담긴 파일밖에 없다면, 전체 유전자 목록으로 데이터셋을 다시 만들어 업로드한 뒤 분석하시기 바랍니다.